近年来，显微细胞图像的分割越来越受到人们的重视。其中对血液细胞图像的分割更多地集中于白细胞及正常红细胞的分割，很少有文献研究存在病变红细胞的图像分割^[1]。主要分割方法除了常用的阈值分割^[2-3]、边缘检测和区域生长^[4-5]等，还涌现出了大量的新兴理论与方法，如基于活动轮廓模型的分割方法^[6-7]，基于神经网络与支持向量机的分割方法^{[5, 8]}，基于模糊聚类的分割方法^[9-10]，基于分水岭变换的分割方法^[10-16]、基于凹点检测与曲线拟合的分割方法^[17]等。其中，分水岭变换因其实现简单、高效，得到了广泛应用。文献[11-12]均采用了结合距离变换的分水岭算法，该算法对强粘连细胞及成像质量不好的图像效果不佳；文献[10]基于待分割细胞形状类圆的假设，定义了评价指标，提出了自适应的H-minima算法，同时结合聚类算法对过分割区域进行合并获得分割结果, 该算法运行效率低，对存在形变与重叠细胞的图像不适用。文献[13-15]采用了结合形态学迭代腐蚀算法的分水岭变换，通过改进极限腐蚀算法的运行终止条件获取内部标记点对血液红细胞图像进行分割，可有效降低错误率，但需要获得单个细胞面积的先验知识，同时对于大片重叠及粘连细胞区域存在很多欠分割。针对含有病变及大量粘连重叠血红细胞的染色图像，提出了自适应标记分水岭分割算法。算法基于HSI模型结合红细胞自身特点提取出中心反光的无核区域，从图像的 $\rm{S}$ 与 $\rm{I}$ 分量的梯度图中提取低频部分的局部极值点，两部分相结合作为初始标记；接着根据伪标记点的特征，删除伪标记，得到图像的前景标记，同时对二值图像的背景区域采用形态学滤波并细化，获得背景标记。在梯度重建时，应用主成分分析提取 $\rm{S}$ 分量与 $\rm{I}$ 分量所含梯度信息，重构梯度图，最后应用标记分水岭变换分割图像。整个算法流程如图 1所示。实验结果表明，本文算法标记准确，可有效提高分割精度，减少分水岭算法中的过分割及欠分割现象。梯度重建过程有效保护了细胞边界，保留了细节，对含有病变、粘连严重及重叠的红细胞图像分割效果好.该算法用于计算机辅助诊断，可辅助医生完成对细胞的准确分割与计数，标定病变细胞，进而间接辅助血液病诊断。

与自然图像不同，彩色细胞图像是对细胞染色后获得的，细胞间色调差别不大， $\rm{RGB}$ 模型并不适合对这类图像进行分析与分割，因此很多分割方法都是先将彩色细胞图像转化为灰度图像再进行分割^{[1-9, 11-17]}, 由于没有充分利用图像的彩色信息，对粘连与重叠细胞的分割精度并不高。HSI模型是从人的视觉系统出发，将颜色空间分为色调H、饱和度 $\rm{S}$ 与亮度 $\rm{I}$ 三个分量，更符合人眼感受颜色的方式。

HSI模型中，色调 $\rm{H}$ 表示颜色的类别、饱和度 $\rm{S}$ 表示纯色被白光冲淡的程度、亮度 $\rm{I}$ 表示颜色的明暗程度。由 $\rm{RGB}$ 模型到 $\rm{HSI}$ 模型的彩色转换为

$ H{\rm{ = }}\left\{ \begin{array}{l} \theta \;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;B \le G\\ 360 - \theta \;\;\;\;B > G \end{array} \right. $

$ \begin{array}{l} \theta = \arccos \left\{ {\frac{{0.5\left[{\left( {R-G} \right) + \left( {R-B} \right)} \right]}}{{\left[{{{\left( {R-G} \right)}^2} + \left( {R-B} \right){{\left( {G-B} \right)}^{1/2}}} \right]}}} \right\}\\ \;\;\;\;\;\;\;S = 1 - \frac{3}{{\left( {R + G + B} \right)}}\left[{\min \left( {R, G, B} \right)} \right]\\ \;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;I = \frac{{R + G + B}}{3} \end{array} $

(1)

式中， ${R}$ 、 ${G}$ 、 ${B}$ 分别表示红、绿、蓝各分量值， ${H}$ 、 ${S}$ 、 ${I}$ 分别表示色调、饱和度、亮度各分量值。

实际运算中，将上述3个分量值变换到[0, 255]范围内。图 2(a)－(c)给出了红细胞染色图，以及 $\rm{S}$ 与 $\rm{I}$ 分量图像。如图 2(a)所示，正常红细胞染色后都呈现淡红色，色调差别细微；由于没有细胞核，且存在反光，细胞中心的 $\rm{S}$ 值会不同程度降低， $\rm{I}$ 值提高；病变部位 $\rm{S}$ 值增大明显；此外，在重叠的细胞边界 $\rm{S}$ 值往往存在较大的差异。使用HSI模型中的 $\rm{S}$ 与 $\rm{I}$ 分量进行数学运算，更有利于去掉病变部位对分割的干扰，分割出粘连与重叠细胞。

阈值分割是最常用的图像分割方法，可以获得关于图像前景的初略信息。如图 2(b)所示, 饱和度最高的区域对应着病变红细胞。通过对 $\rm{S}$ 分量的直方图，使用高百分比(99.9%)估计分割阈值，可获得病变区域，病变区域像素值大于阈值且像素个数占图像总像素数的0.1%，图 2(d)给出了细胞病变区域的标识。

为了更好地分辨出细胞中心无核区域, 采用基于边缘信息的全局阈值分割算法^[18]。步骤如下:

输入:细胞图像的 $\rm{S}$ 分量图。

输出:阈值分割二值图。

1) 提取 $\rm{S}$ 分量的梯度图

$ {g_S}\left( {x, y} \right) = mag\left( {\nabla S} \right) = \sqrt {g_{sx}^2 + g_{sy}^2} $

(2)

式中，$ {{g_{sx}}} $, $ {{g_{sy}}} $分别是使用Sobel算子对 $\rm{S}$ 分量进行水平和垂直方向滤波求得的偏导数，$ mag\left( \cdot \right) $表示对该偏导数做取模运算。

2) 对$ {g_S}\left( {x, y} \right) $在非病变区域使用高百分比估计阈值，通过全阈值分割产生二值图像, $ {g_T}\left( {x, y} \right) $，$ {g_T}\left( {x, y} \right) = 1 $的像素对应于 $\rm{S}$ 图像的强边缘区域$ {M}\left( {x, y} \right) $。

3) 仅对$ {M}\left( {x, y} \right) $中的直方图，运用Otsu方法计算分割阈值，分割 $\rm{S}$ 图像。

细胞病变部位图像梯度幅值较大，以非病变区域作为掩模，消除细胞病变部位对分割的干扰是准确确定阈值的前提。

图 2(e)给出了分割结果，与基于Otsu方法的全阈值分割结果图 2(f)相比，得到更多的细胞中心。对分割后的图像采用形态学填充，可得细胞前景区域。计算各个前景区域的圆形度，圆形度最大的，可认为是单个细胞，其半径记为 $r$ ，作为红细胞的估计半径，用于图像前景标记的提取。

通过对预处理生成的二值图像采用形态学运算，提取红细胞中心作为内部标记。未被标记的细胞，或者光照均匀，细胞内部亮度变化缓慢，或者存在较多重叠，色彩分布均匀，饱和度变化缓慢。这种缓慢变换的特征对应于图像的低频成分^[16]，其局部极小值与细胞有很强的相关性。因此结合亮度与饱和度信息，提取 $\rm{I}$ 与 $\rm{S}$ 分量的梯度图像$ {g_1}\left( {x, y} \right) $与$ {g_S}\left( {x, y} \right) $前景区域的低频成分，取极小值点，可较为精确地标记细胞所在位置。其中$ {g_1}\left( {x, y} \right) $的定义与式(2)类似。

本文选用巴特沃思低通滤波器获取图像低频成分，相比于理想滤波器，该滤波器在通带与阻带之间没有明显的不连续，在高低频率间过渡比较光滑，滤波器函数为

$ H\left( {u, v} \right) = \frac{1}{{1 + \left( {\sqrt 2 - 1} \right){{\left[{\frac{{D\left( {u, v} \right)}}{{{D_0}}}} \right]}^{2n}}}} $

(3)

式中，$ {{D_0}} $代表截止频率，大小为 $M$ × $N$ 的图像在Fourier变换后中心在( $M$ /2, $N$ /2)处， $D$ ( $u$ , $v$ )表示( $u$ , $v$ )到滤波器中心的欧氏距离。$ {{D_0}} $越大，所得梯度图越接近原图，其低频成分的局部极小值点越多，反之极值点越少。一般情况下$ {{D_0}} $的选取范围是20~30之间。

对滤波结果再经过傅里叶逆变换，提取位于图像前景区域的极值点，作为初始标记点集的补充。图 3给出了初始标记点的获取流程。

初始标记精确标记出了细胞位置，但也造成了重复标记，形成伪标记点。主要有3种伪标记点：1)中心反光细胞的梯度低频成分的极小值点，这些点往往在距离细胞中心较远的外侧环形区域，由于细胞中心已被标记，故成为伪标记；2) $ {g_1}\left( {x, y} \right) $与$ {g_S}\left( {x, y} \right) $的低频极小值点同时标记了同一细胞，形成伪标记；3)粘连细胞的重叠区域存在的$ {g_1}\left( {x, y} \right) $或$ {g_S}\left( {x, y} \right) $的低频极小值点。很多文献给出了去除伪标记点的方法^[11-15]，其中文献[11]提出了基于距离的伪标记点去除方法，对没有重叠细胞的图像，这种方法效果较好，但存在大量重叠细胞时，容易保留重叠区域的标记，而误删细胞内部标记。本文结合伪标记点的特征，在文献[11]方法的基础上，提出了改进的启发式算法去除伪标记点，步骤如下：

输入:细胞图像的初始标记图。

输出:修正后的内部标记图。

1) 对已标记中心的红细胞，去除距离中心标记小于 $r$ 的标记点。

2) 对剩下的由低通滤波获得的标记点，计算各标记点间的距离$ {d_{ij}} $，构造邻接矩阵$ {\left[{{a_{ij}}} \right]_m} $为

$ {a_{ij}} = \left\{ \begin{array}{l} 1\;\;\;\;{d_{ij}} < k \cdot r\\ 0\;\;\;\;{d_{ij}} \ge k \cdot r \end{array} \right. $

(4)

式中， $m$ 为标记点个数， $k$ · $r$ 为阈值，本文中 $k$ 选取0.9~1.2之间； $k$ 取值过大容易误删其他粘连细胞中的标记，过小可能漏删伪标记。

3) 找出 $k$ ，使得$ \sum\limits_{i = 1}^m {{a_{ik}}} = \max \left( {\sum\limits_{i = 1}^m {{a_{ij}}} } \right), j = 1, 2, \cdots, m $，删除标号为 $k$ 的标记点，同时令$ {a_{ik}} = {a_{kj}} = 0, \left( {i, j = 1, 2, \cdots, m} \right) $。即去掉邻接点最多的标记点，使得细胞重叠区域不被标记，标记点尽量分散在不同细胞中。

4) 返回步骤3)，直至矩阵$ {\left[{{a_{ij}}} \right]_m} $为零矩阵。

经过上述计算，保留的各标记点之间的距离均大于给定阈值。算法一方面利用了红细胞的无核特性确定了反光红细胞的标记，另一方面充分利用了邻接矩阵中各标记点的位置信息，最大限度地去除了细胞重叠区域的标记点，获得了对所有细胞的更精确标记。图 4(a)－(c)给出了内部标记的获取流程。

为进一步区分图像中的细胞与背景，使用外部标记标注图像的背景区域。由二值图像所产生的背景区域可能包含一部分细胞边界，不适合作为外部标记。对二值图的背景区域采用形态学细化算法。

设背景区域为 $S$ ，结构对 $B$ =( $E$ , $F$ )，利用 $B$ 对 $S$ 进行 $k$ 次细化，细化结果记为$ \left\{ {{S^k}} \right\} $，则

$ \begin{array}{l} \;\;\;\;\;\;\;\;\;\left\{ {{S^k}} \right\} = S \otimes \left\{ {{B^i}} \right\} = \\ \left( { \cdots \left( {\left( {S \otimes {B^1}} \right) \otimes {B^2}} \right) \cdots \otimes {B^k}} \right) \end{array} $

(5)

式中，$ S \otimes B = S - \left( {S \otimes B} \right) $, $ S \otimes B = \left( {A ⊖ E} \right) \cap \left( {{A^C} ⊖ F} \right) $表示使用结构对 $B$ 通过形态学腐蚀运算对 $S$ 做击中或不击中变换。

细化结果只保留了原背景的主干部分，不再含有可能的细胞边界，所得图像的欧拉数与原图相同，不会因连通区域数量的改变导致过分割，细化结果即为图像外部标记。

从HSI模型提取的 $\rm{S}$ 分量的梯度图$ {g_S}\left( {x, y} \right) $在粘连重叠细胞的连接处梯度幅值较大，细胞区分度明显, 但在细胞外侧边界，梯度幅值波动较大，导致细胞边缘不够平滑。与之相反， $\rm{I}$ 分量的梯度图$ {g_I}\left( {x, y} \right) $在细胞边缘更加平滑，但对粘连重叠细胞区分度不大。

主成分分析(PCA)是应用最广泛的数据特征提取方法之一。其基本思想是提取空间原始数据的主要特征，在减少数据冗余的同时保留原始数据的绝大部分信息。将PCA引入梯度计算，从 $\rm{S}$ 与 $\rm{I}$ 分量梯度图中提取梯度信息，可以较好地抑制异常梯度值，获取更多的细节梯度^[20]。

设 $\rm{S}$ 与 $\rm{I}$ 分量的梯度图像组成图像集合$ \mathit{\boldsymbol{f}}\left( {x, y} \right) = \left\{ {{f_1}\left( {x, y} \right), {f_2}\left( {x, y} \right)} \right\} = \left\{ {{g_S}\left( {x, y} \right), {g_I}\left( {x, y} \right)} \right\} $，对集合中的每一个样本$ {{f_i}\left( {x, y} \right)} $用行列堆叠的方式构成$ {N_1} \times {N_2} $维向量$ {f_i} $，这里$ {N_1} \times {N_2} $是原图像的大小，即

$ \begin{array}{l} \;\;\;\;\;\;{\mathit{\boldsymbol{f}}_i}\;\; = \;\;\left[{{f_i}\left( {0, 0} \right), {f_i}\left( {0, 1} \right), \cdots, {f_i}\left( {0, {N_1}} \right), {f_i}\left( {1, 0} \right)} \right., \cdots, \\ {\left. {{f_i}\left( {{N_1}, {N_2}} \right)} \right]^{\rm{T}}} \end{array} $

图像向量$ \mathit{\boldsymbol{f}} = \left[{{\mathit{\boldsymbol{f}}_1}, {\mathit{\boldsymbol{f}}_2}} \right] $，其协方差矩阵为

$ {\mathit{\boldsymbol{C}}_\mathit{\boldsymbol{f}}} = E\left[{\left( {\mathit{\boldsymbol{f}}-{\mathit{\boldsymbol{m}}_\mathit{\boldsymbol{f}}}} \right){{\left( {\mathit{\boldsymbol{f}}-{\mathit{\boldsymbol{m}}_\mathit{\boldsymbol{f}}}} \right)}^{\rm{T}}}} \right] $

(6)

式中， $E$ [·]表示计算统计平均， $\rm{T}$ 为转置，$ {\mathit{\boldsymbol{m}}_\mathit{\boldsymbol{f}}} $为$ \mathit{\boldsymbol{f}} $的均值向量，即$ {\mathit{\boldsymbol{m}}_\mathit{\boldsymbol{f}}} = E\left[\mathit{\boldsymbol{f}} \right] $。则PCA变换为

$ \mathit{\boldsymbol{Y}} = \mathit{\boldsymbol{A}}\left( {\mathit{\boldsymbol{f}} - {\mathit{\boldsymbol{m}}_\mathit{\boldsymbol{f}}}} \right) $

(7)

式中，$ \mathit{\boldsymbol{A}} $是由协方差矩阵$ {\mathit{\boldsymbol{C}}_\mathit{\boldsymbol{f}}} $经过正交变换得到的正交矩阵，$ \mathit{\boldsymbol{Y}} $中每一个列向量就是图像向量f的一个主成分，对应于$ {\mathit{\boldsymbol{C}}_\mathit{\boldsymbol{f}}} $的一个特征值。特征值越小，主成分包含的噪声越多。因此选择特征值最大的第一主成分恢复为图像大小的矩阵作为重建后的梯度图，该图像融合了$ {g_S}\left( {x, y} \right) $与$ {g_I}\left( {x, y} \right) $的主要信息，且消除了噪声的干扰。

将内部标记与外部标记合并得到完整的标记图。由于细胞中病变区域无论是 $\rm{S}$ 还是 $\rm{I}$ 分量，都存在较大梯度幅值，为消除影响，在细胞病变处用梯度均值作为替换，修改重建后的梯度图。在标记的基础上，对修改后的梯度图使用标记分水岭变换，得到最终分割结果。分割流程如图 4所示。

实验数据来自美国社会血液学数据库中的血液病患者的红细胞图像。为验证算法的有效性，将本文算法与文献[11]和文献[13]算法结果分析比较。为达到最佳效果，本实验中各模型参数都是经过多次测试后选取而定。分割结果见图 5。

从分割结果看，图 5第1行是含有弱粘连病变细胞的图像，细胞中心反光严重，文献[11]算法受细胞病变与图像反光影响，仅分割出病变及细胞中心区域，无法分割出细胞原样; 文献[13]算法分割粘连边界时，所得边界较为生硬，而本文算法充分利用梯度信息，获得细胞轮廓更接近真实情况。图 5第2行是粘连重叠细胞图像图，文献[11]算法依旧只分割出细胞中心的反光部位，无法给出细胞真实边界，文献[13]算法未给出细胞的准确定位，造成错误分割。本文算法完全分割出了重叠细胞，分割效果令人满意。对于严重粘连重叠的红细胞图像，如图 5第3行，文献[11]算法结果欠分割严重，未能分割出重叠细胞，而文献[13]算法对重叠细胞分割结果错误严重。本文算法标记准确，精确地分割出所有粘连重叠细胞，同时保持了细胞原有边界。对于含有大量病变与重叠细胞的复杂图像，文献[11]算法结果欠分割严重，很多细胞，尤其是存在病变与反光的细胞，都未分割出完整边界；文献[13]算法在细胞重叠较为严重区域分割效果较差，有较多过分割，上述两种算法对于重叠严重的细胞均存在欠分割；本文算法整体分割效果好，只有左上方图像边缘处两个重叠细胞未能被分割出来。这些细胞无论在饱和度还是亮度方面，在重叠边界处都没有明显梯度变化。当对分割精度要求非常高时，可以基于几何特征提取未能分割出的粘连细胞图像，采用距离变换获得前景标记。重新应用标记分水岭变换进行补充分割。由于只需分割个别粘连细胞，利用距离变换标记前景，比存在大量细胞时，准确度会有很大提高。

表 1为本文算法与文献[11]和文献[13]算法在分割精度和运行时间方面的比较。为方便统计比较，统计图片15幅，均为960×767像素大小，实验环境为: PC机，Intel i3-2350处理器，主频2.30 GHz，2.00 GB内存，编程软件为MATLAB R2010a。其中在图像边界且面积不足正常细胞面积1/4的细胞不纳入统计。由病变及反光产生的中心圈，记为过分割部分。此外，分割出的非细胞成分也作为过分割部分进行计数。采用平均欠分割率、平均过分割率、准确率和平均运行时间作为评价指标。结合统计数据与图 5的分割结果，文献[11]算法受图像光照情况与病变细胞的影响较为严重，不易分割出光照不均及病变细胞，欠分割率高。文献[13]算法虽不受光照与病变细胞影响，但对于团状粘连细胞分割困难，过分割率大，整体分割准确度相对较低。相比于上述两种算法，本文算法平均运行时间在两者之间，分割准确率较高，能够更多地保留重叠与粘连细胞的边界，去除细胞病变与光照不均的影响，鲁棒性高。

针对含有病变及粘连重叠的复杂血红细胞的彩色显微图像，提出了一种基于HSI模型的自适应标记分水岭分割算法。首先从图像饱和度出发，标记出细胞中心反光区域与病变部位，降低了光照不均及病变导致细胞纹理变换对分割的干扰；接着结合亮度与饱和度信息自适应地提取细胞所在位置的标记点，然后运用主成分分析提取亮度与饱和度图像所含是主要梯度信息，去除噪声干扰，重建梯度图像，最后应用标记分水岭变换实现红细胞的自动分割。

本文算法可有效克服分水岭算法中的过分割，对粘连严重，存在形变、质变的红细胞图像的分割具有较高的准确性。在分割过程中同时提取出来细胞的病变部位以及图像的反光区域，在存在大量红细胞的复杂图像中，保留了细胞的原始边界。在临床中的应用意义主要在于可以更加准确地分离出重叠粘连细胞，辅助医生完成对细胞的准确分割与计数，同时对病变细胞进行标定，进而间接辅助对红细胞病变引起的血液病的诊断。

实验结果表明，本文算法对反光的红细胞图像及存在病变的红细胞图像的分割有一定的适应性，但在制片、成像过程中，个别粘连细胞在边界处饱和度与亮度变化非常弱，给分割带来较多困难，如何给出这类细胞的精确边界以及进一步提高算法效率是下一步研究的方向。